|
" توليد نانوتوکسوئيد اپسيلون کلستريديوم پرفرينجنز تيپD و ارزيابي آن در شرائط برون تني "
علي ملائي، مجتبي
| شماره شناسایی
|
:
|
18874261
|
| شماره مدرک
|
:
|
۶۱۶۵۸
|
| نام عام مواد
|
:
|
[گزارش نهایی -ویژه]
|
| شناسه افزوده
|
:
|
علي ملايي، مجتبي
|
|
|
:
|
پيله چيان لنگرودي، رضا
|
|
|
:
|
امامي، تارا
|
|
|
:
|
پرديس، عليرضا
|
|
|
:
|
عزتخواه، مجيد
|
|
|
:
|
شمس الديني، مهرداد
|
|
|
:
|
عباسي، ابراهيم
|
|
|
:
|
عبدالمحمدي خياو، ليدا
|
| عنوان اصلي
|
:
|
توليد نانوتوکسوئيد اپسيلون کلستريديوم پرفرينجنز تيپD و ارزيابي آن در شرائط برون تني
|
| نام نخستين پديدآور
|
:
|
علي ملائي، مجتبي
|
| عنوان اصلي به زبان ديگر
|
:
|
production of Clostridium perfringnes epsilon nano-toxoid and its invitro evaluation
|
| وضعیت انتشار
|
:
|
کرج: موسسه تحقيقات واکسن وسرم سازي رازي، ۱۴۰۱
|
| فروست
|
:
|
شماره ثبت ۶۱۶۵۸ مورخ ۱۴۰۱/۰۳/۱۸۶۱۶۵۸
|
|
|
:
|
شماره طرح : 2-85-18-066-960766
|
|
|
:
|
سامانه سمپات
|
| توصیفگر
|
:
|
کلستریدیوم پرفرنجنس
|
|
|
:
|
توکسن اپسیلون
|
|
|
:
|
نانو توکسو ئید
|
|
|
:
|
واکسن جدید
|
|
|
:
|
PLGA
|
| خلاصه یا چکیده
|
:
|
بیماری انتروتوکسمی بواسطه توکسین های کلستریدیوم پرفرنجنس بخصوص توکسین اپسیلون (ε) ایجاد می شود. اپسیلون بعنوان سومین توکسین کشنده کلستریدیایی معرفی شده است. هدف این پروژه تولید نانوتوکسوئید اپسیلون باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ D و ارزیابی آن است. برای استحصال توکسین اپسیلون، کشت سویه واکسینال CN409 در محیط های اختصاصی رشد و توکسین زایی انجام گردید. خالص سازی توکسین در چند مرحله ترسیب، دیالیز، کروماتوگرافی ستونی، تغلیظ و اولترافیلتراسیون انجام شد. فعالیت توکسین با سنجش حداقل دز کشنده (MLD)، SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی و خلوص آن با الکتروفورز کاپیلاری تعیین شد. تهیه نانوتوکسوئید اپسیلون (NTd-ε) با استفاده از توکسین تخلیص شده، PLGA، و PVA و تشکیل فاز W-O-W انجام شد و NTd-ε در سه فاز انجماد، خشک کردن اولیه و ثانویه لیوفیلیزه شد. محبوس شدن توکسین در نانوذرات با سنجش درصد انكپسولاسيون و ظرفیت احتباس محاسبه و جهت اطمینان از عدم رهاسازی توکسین از NTd-ε، آزمایش ریلیز طی 6 روز و ارزیابی پایداری در بازه زمانی 45 روزه انجام شد. میزان سمیت سلولی NTd-ε در رده سلولی BHK21 برمبنای میزان زنده مانی سلول ها با روش MTT بررسی گردید. جذب سلولی نانوذرات NTd-ε توسط سلول های سیستم ایمنی با سلول های ماکروفاژ و رنگ آمیزی فلورسنت با DAPI، FITC و رودامین بررسی شد. تولید نانوذرات پوشش یافته با وزیکول های غشای گلبول قرمز (RVNTd-ε)، با استفاده از دستگاه اکسترودر و غشاهای پلی کربنات انجام شد. شکل و اندازه ذرات با میکروسکوپ الکترونی SEM و TEM بررسی شد. غیرفعال شدن توکسین اپسیلون در NTd-ε و RVNTd-ε با ارزیابی آثار هیستوپاتولوژی آنها در تزریق داخل جلدی به موش سوری تخمین زده شد. نتایج بیانگر تخلیص خوب توکسین اپسیلون به میزان 87 برابر و خلوص حدود 90 درصد بود. نتایج تهیه نانوذرات NTd-ε نشان داد که نسبت توکسین و PLGA برابر با 1/0 و مقدار PVA برابر با 25/1 % باعث ایجاد نانوذرات با اندازه مناسب در محدوده 150-100 نانومتر می شود. درصد انكپسولاسيون حدود 2/5 ± 65/89 درصد و ظرفیت احتباس نانو ذرات 18/0 ± 57/3 درصد محاسبه شد. نتایج ریلیز نشان داد که روند رهایش توکسین از درون نانوذرات با شیب متعادلی صورت گرفته که بیانگر اتصال موفقیت آمیز توکسین با نانوذرات است. ارزیابی میزان پایداری NTd-ε نیز بیانگر ثبات خوب نانوذرات در بازه زمانی 45 روز بود. بررسی نتایج ارزیابی سمیت سلولی NTd-ε علیه سلول های فیبروبلاست نشان دهنده به دام افتادن توکسین در نانوذرات می باشد. پوشش یافتن NTd-ε با غشاء گلبول قرمز و تولید RVNTd-ε با تصویر برداری الکترونی تایید شد. در تزریق NTd-ε و RVNTd-ε با دزهای بالاتر از دز کشنده توکسین به موش علائم خاصی در موضع تزریق مشاهده نشد. این امر نشان دهنده به دام افتادن توکسین و کاهش قابل ملاحظه خاصیت سمی توکسین اپسیلون می باشد. در واقع نانوذرات مانند یک توکسوئید عمل کرده اند و میتوان با ارزیابی قدرت ایمنی زایی آن در مطالعات آتی پتانسیل کاربرد آنرا بعنوان واکسنی جدید تعیین نمود.
|
|
|
:
|
Enterotoxemia is caused by Clostridium perfrigens toxins, especially epsilon toxin, which is introduced as the third clostridial lethal toxin. The aim of this study is the production and evaluation of epsilon nanotoxoid of the C. perfrigens. To extract epsilon toxin, culturing of vaccine C. perfrigens type D strain (CN409) was performed in exclusive media. Then the toxin was purified by precipitation, dialyzing, column chromatography, concentration, and ultrafiltration, and its purification determined by capillary electrophoresis. The activity of the purified toxin was evaluated according to minimal lethal dose (MLD), SDS-PAGE, and western blotting. By the use of purified toxins, PLGA, and PVA, the epsilon nanotoxoid (NTd-ε) was prepared according to W-O-W phase formation and then lyophilized. The ratio of encapsulation efficiency and loading capacity of NTd-ε was calculated, and also the release kinetics test was performed during 6 days to ensure no release of epsilon from NTd-ε. The stability of the structure was monitored over 45 days. Then NTd-ε cytotoxicity in BHK21 cell line was evaluated based on cell viability by the MTT method. The cellular uptake of NTd-ε nanoparticles by immune cells was assessed using macrophage cells and fluorescent staining with DAPI, FITC, and rhodamine. NTd-ε nanoparticles were coated by red blood cell membrane vesicles to create RVNTd-ε by polycarbonate membranes and extruder equipment, and their morphology was observed by SEM and TEM electron microscopes. The inactivation of the epsilon toxin in NTd-ε and RVNTd-ε was estimated by evaluating histopathological effects at intradermal injection into mice. According to the results, the toxin purity was 90%. The best ratio of PLGA and PVA to the toxin was 0.1 and 1.25%, respectively, to obtain an appropriate nanoparticles size (100-150 nanometers, approximately). The encapsulation efficiency and loading capacity of NTd-ε were 89.65% ± 5.2 and 3.57 % ± 0.18. Based on the release kinetic results, the toxin release had a balanced slope, which indicates the successful binding of the toxin to the nanoparticles. The stability of NTd-ε was striking during 45 days. Also, the cytotoxicity test against fibroblasts approved that this toxin is trapped in the nanoparticles. Coverage of NTd-ε with erythrocyte membrane and RVNTd-ε production confirmed by electron imaging. Injecting NTd-ε and RVNTd-ε with higher doses than the lethal dose of epsilon toxin to mice showed no specific symptoms at the injection site. This indicates the trapping of the epsilon toxin and a significant reduction in the ε toxicity. In fact, these nanoparticles have acted as a toxoid and can be used as a new vaccine by evaluating its immunogenicity in future studies.
|
| |