|
" بررسی توان بیوکنترلی و بیوفرتیلایزري سویه هاي مهندسی پروتپین شده تریکودرما درگیاه لوبیا وتعیین اثرات جدایه هاي منتخب بر عملکرد و مقاومت گیاه "
| شماره شناسایی
|
:
|
18868220
|
| شماره مدرک
|
:
|
۶۰۱۰۷
|
| نام عام مواد
|
:
|
[گزارش نهایی -تجاری]
|
| شناسه افزوده
|
:
|
کوثری، مژگان
|
|
|
:
|
زمانی، محمدرضا
|
|
|
:
|
مطلبی، مصطفی
|
| عنوان اصلي
|
:
|
بررسی توان بیوکنترلی و بیوفرتیلایزري سویه هاي مهندسی پروتپین شده تریکودرما درگیاه لوبیا وتعیین اثرات جدایه هاي منتخب بر عملکرد و مقاومت گیاه
|
| عنوان اصلي به زبان ديگر
|
:
|
:Study of biocontrol and biofertilizer activity of protein engineered isolates of Trichoderma in bean plant and determine the effects of selected isolates on yield and plant resistance
|
| صفحه شمار
|
:
|
۱۸۷ ص.:مصور، عکس(رنگی)، جدول، نمودار
|
| وضعیت انتشار
|
:
|
کرج: پژوهشگاه بیوتکنولوژي کشاورزي، ۱۳۹۸
|
| فروست
|
:
|
شماره ثبت ۶۰۱۰۷ مورخ ۱۴۰۰/۰۶/۰۲۶۰۱۰۷
|
|
|
:
|
شماره طرح ۹۵۱۰۸۳-۰۳۷-۰۵۵۱-۰۵-۳
|
|
|
:
|
شماره نامه: سامانه سمپات
|
|
|
:
|
این طرح: ترویجی است
|
| خلاصه یا چکیده
|
:
|
افزایش نیاز جامعه کنونی به تولیدات کشاورزي و کیفیت محصولات، باعث افزایش میزان مصرف کودها وسموم شیمیایی شده است که نتیجه این رویکرد، آلودگیهاي جدي زیست محیطی است. استفاده از عوامل بیوکنترل یک راه کاهش این اثرات مخرب است. آنزیم¬هاي تخریب کننده دیواره سلولی تریکودرما،نقشی اساسی در کنترل عوامل بیماریزاي گیاهی دارد. در بین این آنزیم¬ها، کیتینازها جزء اصلیترین گروه آنزیمی دخیل در فعالیت بیوکنترلی قارچ تریکودرما می¬باشند. اعتقاد بر این است که در بین کیتینازها،آنزیم کیتیناز 42 مهمترین نقش را در فعالیت کیتینازي ایفا میکند. کیتیناز 42 harzianum. Trichodermaفاقد دومین اتصال به کیتین ( Domain (Binding Chitin است. این دومین باعث افزایش اتصال آنزیم به سوبسترا می¬شود. لذا در مطالعات قبلی، جهت افزایش فعالیت آنزیمی کیتیناز 42 ،ChBD آنزیم کیتیناز18 -10 قارچ atroviride. T جداسازي و به کمک مهندسی پروتئین توسط لینکر به انتهاي آمینی کیتیناز 42بعد از ناحیه سیگنال پپتید متصل شد و پروتئین کایمر به قارچ harzianum. T منتقل گردید و چندین سویهنوترکیب بدست آمد. سپس توان بیوکنترلی و محرك رشدي سویههاي نوترکیب در شرایط آزمایشگاه و شرایط گلخانه بر روي گیاه لوبیا و بیماري رایزوکتونیایی لوبیا مورد بررسی قرار گرفت و در نهایت دو سویهمنتخب T13 و T15 جهت ادامه تحقیق در نظر گرفته شد. در این پژوهش دو سویه مذکور که از نظر محرك رشدي و توان بیوکنترلی متفاوت هستند در مسیرهاي مولکولی و بیوشیمیایی رشد و مقاومت گیاهلوبیا تحت تأثیر پاتوژن رایزوکتونیا AG4 در مقایسه با سویه وحشی harzianum. T بررسی شدند. در راستاي دستیابی به اهداف پژوهش ابتدا پایداري ژن کیتیناز کایمر در سویه¬هاي نوترکیب تأیید شد و ٥سپس صفات مفید درگیر در فعالیت بیوکنترلی و محرك رشدي سویه¬هاي تریکودرما از جمله فعالیتآنتاگونیستی علیه رایزوکتونیا به روش کشت دو گانه، بررسی بیان ژن¬هاي دخیل در مقاومت و فعالیتکلونیزاسیون شاملchit42 ، qid74 ،Thpg1 و tex10 با تکنیکPCR time-real ، تولید متابولیتهايبیوشیمیایی مانند اکسین با تکنیک HPLC و سیدورفور بر پایه محیط agar-CAS ،تأثیر بر انحلال پذیريعناصر فسفر و پتاسیم و نیز میزان تحمل به تنش شوري و همچنین ترکیبات فرار تولید شده از آنها به روش SPME-GCدر شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. در شرایط گلخانه نیز میانکنش سه گانه گیاهلوبیا- تریکودرما و پاتوژن رایزوکتونیا در مسیرهاي رشد و مقاومت بررسی گردید. در مسیر رشد گیاه میزانرشد رویشی (قسمت هوایی و ریشه) و زایشی (گلدهی و عملکرد)، بیان ژنهاي درگیر در رشد ریشه شاملNAC1 ،EXP1 و DGL1 و ژنهاي گلدهی از جمله FT و SOC1 با تکنیک PCR time -real مورد بررسی قرار گرفت. در مسیر مقاومت گیاه نیز ابتدا توان بیوکنترلی سویههاي تریکودرما در مقابل رایزوکتونیا بر روي ریشه لوبیا بررسی شد و سپس در مسیر مولکولی بررسی بیان ژنهاي LOX1 ، PDF وCH5bدرگیر در مقاومت ISR و ژنهاي PR1 و PR2 درگیر در مقاومت SAR با تکنیک time-real PCRانجام شد. همچنین به منظور تأثیر سویههاي تریکودرما بر دفاع سلولی در مسیر بیوشیمیایی مقاومت گیاه، میزان آنزیمهاي آنتی اکسیدان از جمله کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز و نیز میزانپراکسید هیدروژن و مالون دي آلدهید اندازه گیري گردید. نتایج مطالعات آزمایشگاهی سویههايتریکودرما نشان داد که T15 با درصد بازدارندگی 92 % بیشترین اثر بازدارندگی را روي رشد رایزوکتونیانسبت به سویه نوترکیب T13) 85 (%و سویه وحشی (50 (%داشته است. نتایج آنالیز بیان ژنهاي تریکودرمانیز افزایش معنیدار رونوشتهاي ژنهاي مورد بررسی نسبت به سویه وحشی را نشان داد. سویههاينوترکیب همچنین در تولید متابولیتهاي بیوشیمیایی اکسین و سیدروفور نسبت به والد وحشی خود افزایشنشان دادند بهطوريکه سویه نوترکیب T13 بیشترین میزان تولید اکسین و سیدروفور را نشان داد. سویههاي٦نوترکیب در افزایش انحلال پذیري فسفر و پتاسیم و نیز میزان تحمل به تنش شوري در مقایسه با سویهوحشی کارامدتر بودند. علاوه بر این، آنالیز ترکیبات فرار تولید شده از سویههاي تریکودرما در مجموع 57 ، 29 و 11 ترکیب را به ترتیب ازT15 ، T13 و Tw نشان داد. بیشتر ترکیبات فرار تولید شده از T13 و T15داراي نقش بیوکنترلی و محرك رشدي بودند. در شرایط گلخانه، تیمارهاي T13 و T15 به ترتیب87 %و 37 %درصد در طول ریشه ، 8/2 و 5/1 برابر در وزن خشک ریشه نسبت به شاهد (گیاه بدون تیمار) افزایش نشان داد . سویه T13 در حضور و عدم حضور رایزوکتونیا نیز به ترتیب موجب افزایش 4 و 5/2برابري وزن تر ریشه نسبت به شاهد شد. در این تحقیق سویههاي تریکودرما باعث افزایش وزن تر ساقه شدند. وجود تریکودرماهاي نوترکیب T13 و T15 وزن تر ساقه را بهمیزان 88 %و 52 %نسبت به شاهد افزایشدادند. در حالی که گیاه تیمار یافته با سویه وحشی با گیاهان شاهد اختلاف معنیدار نداشتند. تاثیر سویههاينوترکیب T13 و T15 بر ارتفاع و قطر ساقه نیز چشمگیر بود، بهطوري که سویه T13 موجب افزایش 24%ارتفاع ساقه و سویهنوترکیب T15 موجب افزایش 100 %قطر ساقه نسبت به شاهد شدند. در مرحله زایشی نیز نتایج نشان داد که گیاهان تیمار یافته با سویههاي نوترکیب افزایش معنیداري در تعداد گل و نیز گلدهیزودتر نسبت به والد وحشی و گیاهان شاهد داشتند. همچنین گیاهان تیمار یافته با سویههاي نوترکیب تفاوت معنیداري در تعداد و وزن غلاف نسبت به گیاهان تیماریافته با سویهوحشی تریکودرما و گیاهان بدون تیمارنشان دادند. در مسیرهاي مولکولی بیان ژنهاي درگیر در رشد ریشه و گلدهی، بیان بالاتر ژنهاي مورد نظر در گیاهان تیمار یافته با سویههاي نوترکیب بویژه سویه T13 مشاهده شد. در بررسی میزان بیوکنترلی سویه- هاي تریکودرما در برابر رایزوکتونیا در شرایط گلخانهاي، گیاهان تیمار یافته با سویههاي نوترکیب T15 و T13به ترتیب به میزان 41/0 و 57/0 برابر بیماري کمتري نسبت به سویه وحشی نشان دادند. هنگامی که گیاهان با سویه هاي نوترکیب تریکودرما تلقیح شدند، القاء مقاومت گیاه لوبیا به دلیل افزایش فعالیت آنزیمهاي آنتی اکسیدان و نیز افزایش سطح بیان ژن هاي مربوط به مسیرهاي دو گانه مقاومت نسبت به گیاهان٧تیمار یافته با سویه وحشی تریکودرما مشاهده شد، که نشان دهنده توانایی آنها براي کلونیزاسیون بهتر در خاك و سطح ریشه است که این امر می تواند اثرات مثبت آنها در مقاومت گیاه در حضور پاتوژن توصیفنماید. با توجه به نتایج بدست آمده در این پژوهش، استفاده از سویههاي نوترکیب تریکودرما سبب افزایشرشد و مقاومت نسبت به سویه وحشی گردید و ضمن بهبود ویژگیهاي رشدي، سبب افزایش عملکرد و مقاومت گیاه را نیز در بر داشت. بنابراین می توان سویههاي نوترکیب را به عنوان عوامل بالقوه بیوکنترل و بیوفرتیلایزر در مدیریت بیماري و کشاورزي مدرن معرفی نمود.
|
|
|
:
|
In recent years increasing use of all chemical inputs, including fertilizers and crop protection agents due to the demand for extra cultivations and quality, has become a major problem for the environment. From this point of view, biological control agents can often be a very successful means of reducing these adverse consequences. In this regard, one of the most suitable biological control agents of phytopathogenic fungi is Trichoderma fungi whose cell wall degrading enzymes play a major role in the control of phytopathogens. Of these enzymes, the main enzymatic group involving in the bio-control activity of Trichoderma are Chitinases which believed that among them chitinase 42 plays the main role in chitinase activity. Chitinase binding domain which is not present in chitinase 42 of T. harzianum seems to enhance the binding of the enzyme to a substrate and opens up the possibility of binding to the insoluble substrate. During the previous experimental work, the authors attempted to enhancing the activity of this enzyme through purification of CHBD enzyme chitinase of 10-18 T.atrovide and adding them by linker to amino-terminal sequence of chitinase 42 just after peptide signal site using protein engineering, then the chimera protein-producing gene transferred to T. harzianum and several recombinant strains were produced. Then, the biocontrol and biofertilizer potential of recombinant strains were investigated on bean plant and bean Rhizoctonia disease in vitro and greenhouse conditions. Finally, T13 and T15 recombinant strains were selected for further research. In this study, T13 and T15 strains that differ in biocontrol and biofertilizer activity were investigated in the molecular and biochemical pathways of bean plant growth and resistance under the influence of Rhizoctonia AG4 in comparison with T. harzianum wild-type strain. To achieve this goal, the first the stability of chimeric chitinase gene in recombinant strains was confirmed and then the beneficial traits involved in biocontrol and biofertilizer of Trichoderma strains including antagonistic activity against Rhizoctonia by dual culture method, genes expression assay involved in resistance and colonization activity including chit42, qid74, Thpg1 and tex10 by Real-time PCR technique, production of biochemical metabolites such as auxin by HPLC technique and siderophores based on CAS-agar medium, the effect on solubility of phosphorus and potassium and the tolerance to salinity stress as well as the volatile compounds produced of Trichoderma strains by GC-SPME method was investigated in vitro condition. In the greenhouse conditions, the triple interaction of bean-Trichoderma and pathogen R.solaniin growth and resistance pathways was investigated. In the growth pathway, the vegetative ١٦٤growth parameters (shoot and root) and reproductive (flowering and yield), expression of genes involved in root growth including NAC1, EXP1 and DGL1, and genes involved in flowering including FT and SOC1 by Real-time PCR technique were evaluated. In the plant resistance pathway, the biocontrol potential of Trichoderma strains against R. solaniwas investigated on the root of beans. then on the molecular pathway, the expression of LOX1, PDF and CH5b genes (involved in the ISR resistance) and PR1 and PR2 genes (involved in the SAR resistance) was studied by real-time PCR. Also, to analyze the effect of Trichoderma strains on cell defense in the biochemical pathways of plant resistance, antioxidant enzymes such as catalase, peroxidase and ascorbate peroxidase, as well as hydrogen peroxide and malondialdehyde was measured. The results of in vitro studies of Trichoderma strains showed that T15 with 92% inhibition had the highest inhibitory effect on the growth of R. solani compared to recombinant T13 (85%) and Tw strains (50%). The results of an analysis of expression of Trichoderma genes also showed a significant increase in the transcripts of the genes studied compared to the wild-type Recombinant strains also showed an increase the production of auxin and siderophore than their wild parent so that T13 strain showed the highest amount of auxin and siderophore production. Recombinant strains were more efficient in increasing solubility of phosphorus and potassium and tolerance to salinity compared to wild type. Besides, analysis of volatile compounds produced by Trichoderma strains revealed a total of 57, 29 and 11 compounds, respectively for T15, T13, and Tw. Most of the volatile compounds produced from T13 and T15 had a biocontrol and growth-stimulating role. In the greenhouse conditions, T13 and T15 treatments showed 87% and 37% increase in root length, 2.8 and 1.5 times higher root dry weight than control, respectively. The T13 strain in the presence and absence of R. solani also increased root fresh weight by 4 and 2.5 times, respectively than that of the control plants. In this study, the Trichoderma strains increased stem fresh weight. T13 and T15 strains increased shoot fresh weight by 88 and 52%, respectively than the control plants, whereas the wild-type treated plant had no significant difference with the control plants. The effect of T13 and T15 recombinant strains on stem height and diameter was also significant so that T13 strain increasing 24% shoot height and T15 recombinant strain increasing 100% stem diameter than the control plants. Also, in the reproductive stage, the results showed that the bean plants treated with recombinant strains had a significantly increased number of flowers and earlier flowering compared to the control and Trichoderma wild type. Also, plants treated with recombinant strains showed a significant difference in the number and weight of the pod compared to ١٦٥the plant treated with wild type strain and non-treated plants. In the molecular pathways, the expression of genes involved in root growth and flowering also showed higher expression in plants treated with recombinant strains, especially T13 strain. In the biocontrol study of Trichoderma strains against R. solani in greenhouse conditions, recombinant strains T15 and T13 showed 41% and 57% lower disease than wild- type strain, respectively. When the plants were inoculated with recombinant strains, induction of bean resistance was observed due to increased activity of antioxidant enzymes and also increased expression of genes related to dual pathways of plant resistance than the plant treated with Trichoderma wild-type strain indicating their ability to have better colonization within the soil and the root surface, which would describe its positive effects on defense in the presence of the R. solani. According to the results of this study, the use of Trichoderma recombinant strains increased growth and resistance than the wild-type strains and also the improving growth characteristics, it also increased plant yield and resistance. Therefore, recombinant strains can be introduced as potential biocontrol and biofertilizer agents in modern disease management and agriculture
|
| |