رکورد قبلیرکورد بعدی

" توليد متابوليت هاي زيست فعال والرنيک اسيد گياه دارويي سنبل الطيب (Valeriana officinalis) و هايپرسين و هايپرفورين گل راعي (Hypericum perforatum) از کشت ريشه مويي و نابجا در بيوراکتور "


شماره شناسایی : 18876144
شماره مدرک : ۶۲۶۲۰
نام عام مواد : [گزارش نهایی -تجاری]
شناسه افزوده : ابراهيمي، مرتضي
: ابراهيمي، مرتضي
: ابراهيمي، مرتضي
: خان احمدي ورنوسفادراني، مرتضي
عنوان اصلي : توليد متابوليت هاي زيست فعال والرنيک اسيد گياه دارويي سنبل الطيب (Valeriana officinalis) و هايپرسين و هايپرفورين گل راعي (Hypericum perforatum) از کشت ريشه مويي و نابجا در بيوراکتور
نام نخستين پديدآور : ابراهيمي، مرتضي
عنوان اصلي به زبان ديگر : Production of the bioactive metabolites valerenic acid from Valeriana officinalis, and hypericin and hyperforin from Hypericum perforatum through adventitious and hairy root cultures in bioreactors
وضعیت انتشار : کرج: پژوهشگاه بيوتکنولوژي کشاورزي، ۱۴۰۱
فروست : شماره ثبت ۶۲۶۲۰ مورخ ۱۴۰۱/۰۹/۱۵۶۲۶۲۰
: شماره طرح : 01-05-05-010-95010
: سامانه سمپات
توصیفگر : ریشه موئین
: ریشه نابجا
: گل راعی
: سنبل الطیب
: بیورآکتور
: هایپرسین
: هایپرفورین
: والرنیک اسید
خلاصه یا چکیده : گیاهان دارویی به دلیل تأثیر بر سلامت بشر، به موضوعی جهانی تبدیل شده‌اند. داروهای گیاهی، نقش مهمی در سیستم مراقبت‌های بهداشتی در سراسر جهان بازی می نمایند. ایده تکثیر اندام گیاهی در محیط کنترل شده با هدف تولید محصول چندین دهه قدمت دارد و پژوهش برای کشت ریشه های مویین و نابجا با هدف تولید متابولیت های ثانویه گیاهی از حدود نیم قرن قبل آغاز شده است. هر روز ریشه های مویین گیاهان جدید و متابولیت های جدید گزارش می شود. گیاهان دارویی گل‌راعی (Hypericum perforatum L..) و سنبل الطیب (Valeriana officinalis) از جمله مهمترین و قدیمی ترین گیاهان شناخته شده داروئی هستند که قدمت استفاده داروئی از آنها به حدود 2 هزار سال پیش بر می گردد. هایپریسین و هایپرفورین دو ترکیب اصلی و مهم دارویی گل راعی به شمار می‌روند و در ریشه های سنبل الطیب ماده والرنیک اسید یکی از مهمترین ترکیبات داروئی است. کشت این گیاهان در مزرعه با مشکلات مرتبط با سایر گیاهان دارویی همراه است. تجمع اقتصادی متابولیت‌های مذکور به دو تا سه سال زمان نیاز دارد. تغییرات محیطی اثرات زیادی بر میزان تولید این ترکیبات می‌گذارند. به علاوه به دلیل عملکرد پایین و محدودیت جدی مرتبط با منابع آب، پژوهش برای تولید اقتصادی متابولیت های مورد بحث در بیوراکتور را توجیه پذیر می‌کند. لذا در این طرح روش¬های القای ریشه های نابجا و موئین از ریز نمونه¬های مختلف و بهینه سازی محیط کشت مناسب جهت افزایش بیومس بهینه سازی گردید تا امكان تولید از طریق کشت ریشه بیورآکتور بررسی ‌گردد. در این طرح تأثیر الیسیتورها بر نوسان میزان متابولیت‌های ثانویه بررسی شد. همچنین برای اقتصادی نمودن تولید ریشه اقدام به بومی سازی و طراحی بیورآکتورهای ارزان قیمت شد. هر یک از موضوعات فوق الذکر به شکل یک پروژه و جمعا سه پروژه در غالب طرح تحقیقاتی فعلی به اجرا در آمد. در پروژه اول بر روی ریشه نابجای گل راعی تاثیر سطوح مختلف محیط MS بر رشد ریشه نابجا بررسی گردید. بیشترین وزن‌تر ریشه در محیط MS کامل (09/30 گرم بر لیتر) بدست آمد، اما بیشترین مقدار وزن خشک مربوط به محیط MS2/1 (1056 میلی‌گرم بر لیتر) بود. همچنین، بیشترین میزان فنل و فلاوونوئیدها در محیط کشت MS4/1 به دست آمد. در بررسی تأثیر الیسیتورها مشاهده شد که غلظت‌های مختلف نانوذره نقره بر میزان فنل، فلاونوئید، هایپریسین، سودوهایپریسین و هایپرفورین و نیز درصد فعالیت آنتی‌اکسیدانی DPPH قابل توجه است به نحوی که غلظت ppm 20 نانوذره نقره دارای بیشترین تأثیر بر میزان فنل نسبت به تیمارهای اعمال شده بود (113/3 میکرو‌گرم بر گرم وزن خشک) بوده است. در آزمایش دیگر که به منظور بررسی اثر نور ماورا بنفش به عنوان الیسیتور طراحی شد، بیشترین میزان هایپرسین (1/3 میکروگرم بر گرم وزن خشک) در تیمار تابش 60 دقیقه‌ای UV-B به دست آمد. همچنین، در مجموع در بهترین حالت تیمار دمایی 4 درجه سانتی گراد (به عنوان الیسیتور غیر زیستی) به مدت یک هفته سبب تحریک تولید هایپرسین تا حدود 6 میکروگرم بر گرم وزن خشک ثبت شد که با افزایش حدود 12 برابری به طور معنی داری نسبت به شاهد با حدود 5/0 میکروگرم بر گرم وزن بیشتر بود. به منظور بهینه سازی محیط کشت القای ریشه نابجا از ریزنمونه برگ، استفاده همزمان 3 میلی¬گرم بر لیتر IBA با 45 میلی¬گرم بر لیتر تریپتوفان سبب ثبت بیش از 96% ریشه زایی شد که به طور معنی داری نسبت به سایر تیمارها بیشتر بود. در برنامه غربالگری لاین های ریشه نابجا، تعداد 230 لاین ریشه نابجا تولید از بین آنها تعداد 9 لاین با سرعت رشد بالاتر نگهداری و بقیه حذف گردیدند. میزان هایپرسین، هایپرفورین، فنل و فلاونوئید موجود در ریشه نابجای 4 هفته ایی 9 لاین منتخب و مقایسه آن با شاهد انجام شد. بیشترین میزان هایپریسین در لاین شماره 3 با حدود 45/0 میکروگرم بر گرم وزن خشک مشاهده شد. این میزان از هایپرسین حدود 37 برابر زمانی است که لاین فاقد بیان کافی متابولیت هایپریسین تحت تأثیر الیسیتور قرار گرفت. همچنین با اجرای برنامه تغییر فاز رشدی در یکی از لاین ها پس از 8 هفته حدود 321/2 میلی گرم بر گرم وزن خشک هایپرسین تولید شد. در پروژه دوم بیوراکتور مناسب برای کشت یک لاین پر رشد ریشه نابجای گل راعی تولید و تست گردید. بیوراکتور در شکل های مختلف ساخته و بررسی های لازم صورت گرفت و در نهایت بیوراکتور استوانه ای با حفاظ توری فلزی بدلیل سادگی ساخت و بزرگ سازی انتخاب گردید. با توجه به اهمیت الگوی هوادهی بر توزیع مناسب ریشه در بیوراکتور الگوهای مختلف بررسی و هواده های مناسب برای این منظور توسعه یافت. بیوراکتور های 15 لیتری به این روش ساخته شد و کشت ریشه مورد نظر در آن انجام گرفت و 13 گرم ریشه خشک بر لیتر با تکرار پذیری مناسب در آن تولید گردید که به مقادیر تولید شده در ظروف آزمایشگاهی و بیوراکتورهای 3 لیتری شیشه ای نزدیک است. سپس بیوراکتور30 لیتری و 60 لیتری نیز ساخته و تست گردید. در بیوراکتور 60 لیتری نیز مقدار 10 گرم بر لیتر ماده خشک تولید گردید که براساس منابع منتشره مقدار استاندارد در مقیاس پایلوت است. یکنواختی تولید متابولیت در نقاط مختلف بیوراکتور قابل قبول بود. برمبنای داده های بدست آمده در این پژوهش هزینه تولید ریشه در بیوراکتور 200 لیتری از نوع تولید شده در این پژوهش برآورد گردید. براساس نتایج قیمت تمام شده هر کیلوگرم وزن خشک ریشه حدود 2 میلیون ریال است که برای برخی از محصولات مقرون بصرفه است. در پروژه سوم نیز تولید ریشه مویین حاوی والرنیک اسید در سنبل الطیب و کشت نیمه انبوه آن در بیورآکتور مورد بررسی قرار گرفته است. از بین لاین های تولید شده با استفاده از سه سویه آگروباکتریوم رایزوژنز پس از غربالگری تعداد 30 لاین پر رشد جهت بررسی میزان تولید والرنیک اسید انتخاب و در انتها سه لاین پرعملکرد جهت بررسی های بعدی مورد استفاده قرار گرفت. بین سویه ها به لحاظ درصد تراریختی و خصوصیات مورفولوژیکی تفاوت معنی دار وجود داشت و سویه MSU440 به طور معنی داری نسبت به دو سویه دیگر ریشه مویین با وزن خشک و وزن تر بالاتری تولید نمود. بیشترین میزان وزن تر (74/16 گرم) ، بالاترین وزن خشک (69/1) گرم و بیشترین نسبت وزن خشک به وزن تر (25 درصد) به ترتیب در لاین های M-3 ، M-17 (لاین های حاصل از سویه MSU440) و A4 (لاین حاصل از سویه ATCC 15834) به دست آمد. در آزمایشات مرتبط به بهینه سازی محیط کشت پایه 3 نوع محیط کشت مایع مختلف شامل غلظت های یک‌دوم ماکروی MS، SH و B5 مورد بررسی قرار گرفت و نتایج نشان داد که بین محیط های کشت تفاوت معنی دار از نظر تولید بایومس وجود دارد. در خصوص محتوای والرنیک اسید، بیشترین مقدار (حدود 58/0میلی‌گرم بر گرم وزن خشک ریشه مویین) متعلق به لاین MSU در محیط کشت 1/2SH بود. مقایسه میانگین اثر زمان و الیسیتور نشان داد که بالاترین محتوای والرنیک اسید از تیمار 6 روزه با متیل جاسمونات ( 6/0 میلی گرم در گرم وزن خشک ریشه) و تیمار 10 روزه کلسیم (53/0 میلی‌گرم در گرم وزن خشک ریشه) به دست آمد. پایین‌ترین میزان والرنیک اسید در زمان 12 روز و با اعمال الیسیتور کیتوزان (14/0 میلی‌گرم در گرم وزن خشک ریشه) مشاهده شد.
: Medicinal plants are attracting attention all over the world because they affect human health. Herbal medicines play an important role in healthcare systems around the world. The idea of plant propagation in a controlled environment for the purpose of producing secondary metabolites is decades old, and research to cultivate hairy and adventitious roots with the aim of producing secondary plant metabolites began about half a century ago. New hairy roots and new metabolites are reported daily. Medicinal plants (Hypericum perforatum L.) and Valeriana officinalis are one of the most significant and oldest known medicinal plants, and their use dates back about 2,000 years. Hypericin and hyperforin are the two most essential substances of Hypericum perforatum L., and valerenic acid is one of the most important ingredients of the Valeriana officinalis root. Growing these plants in the field has problems same as other medicinal plants. The economic accumulation of these metabolites takes 2-3 years. Changes in the environment have a major impact on the production of these compounds. In addition, the poor and restrictive performance associated with water resources requires research into the economic production of metabolites in bioreactors. Therefore, in this project, adventitious and hairy roots which can be derived from different explants, optimizing the appropriate medium to increase biomass, and the potential for production by root culture in the bioreactor, the effect of elicitors on the fluctuation of secondary metabolites were investigated. Besides, in order to economic production, cheap bioreactors were localized and designed. Each of the above issues was implemented in the form of a single project and then, all projects were reported as a unit research plan. In the first project, the impact of various levels of MS medium on the growth of adventitious roots of hypericum perforatum was investigated. The highest root weight (30.09 g /l) was obtained in complete MS medium but the highest dry weight (1056 mg / l) was in MS1/2 medium. Also, the highest content of phenols and flavonoids was obtained in MS4 culture medium. In the study of the effect of elicitors, it was observed that different concentrations of silver nanoparticles on the amount of phenol, flavonoids, hypericin, pseudohypericin and hyperforin and also the percentage of antioxidant activity of DPPH are statistically significant. Based on the results, 20 ppm nano-silver had the most effect on the content of phenol (3.113 μg/g dry weight). In another experiment designed to investigate the effect of ultraviolet light as an elicitor, the highest amount of hypericin (3.1 μg/g dry weight) was obtained in a 60-minute UV-B irradiation treatment. Also, in general, the temperature treatment of 4°C (as a non-biological elicitor) for one week caused the stimulation of hypericin production up to about 6 μg/g dry weight, which increased by about 12 times compared to the control (0.5 μg/g dry weight). In order to optimize the culture medium for adventitious root induction from leaf explants, simultaneous use of 3 mg/l IBA with 45 mg/l tryptophan resulted in more than 96% roots, which was significantly higher than other treatments. In the adventitious root line selection program, 230 root lines were produced, of which 9 lines with higher growth rate were maintained, and the rest were removed. The levels of hypericin, hyperforin, phenol and flavonoids in the 4-week-old roots of selected lines were compared with the control. The highest amount of hypericin was observed in line number 3 with about 0.45 μg/g dry weight. This amount of hypericin is about 37 times more than those lines which lacked adequate expression of the hypericin metabolite but were exposed to elicitor treatment. Also, by implementing a growth phase change program in one of the lines, after 8 weeks, about 2.321 mg/g of dry weight of hypericin was produced. In the second project, a suitable bioreactor was produced and tested for the cultivation of a superior root line. Bioreactors were made in different shapes and necessary studies were performed, and finally a cylindrical bioreactor with metal mesh protection was selected due to its simplicity of construction and scale up. Due to the importance of the aeration model on the proper distribution of roots in the bioreactor, different models were studied, and suitable aerators were developed for this purpose. 15-liter bioreactors were made in this way and the desired root culture was performed in it and 13 grams of dry roots per liter were produced with suitable reproducibility, which is close to the values produced in laboratory containers and 3-liter glass bioreactors, then 30 and 60-liter bioreactors were made and tested. In a 60-liter bioreactor, 10 grams per liter of dry matter was produced, which according to published sources is the standard value on a pilot scale. The uniformity of metabolite production at different bioreactor sites was acceptable. Based on our results, the cost of root production in a same type 200-liter bioreactor was estimated. According to this, the cost price per kilogram of dry weight of the root is about 2 million rials, which is affordable for some products. In the third project, the production of hairy roots containing valerenic acid in Valeriana officinalis and its semi-mass production in bioreactors have been investigated. Among the lines produced using three strains of Agrobacterium rhizogenesis, after screening, 30 high-growth lines were selected to evaluate the production of valerenic acid and at the end, three high-yield lines were used for further studies. There was a significant difference between the strains in terms of transformation percentage and morphological characteristics. The MSU440 strain produced significantly higher hairy root dry and fresh weight than the other two strains. The highest fresh weight (16.74 g), the highest dry weight (1.69 g) and the highest dry weight to fresh weight ratio (25%) were in the M-3 and M-17 lines (line derived from MSU440) and A4 (line derived from ATCC strain 15834) were obtained respectively. In experiments related to the optimization of the basal culture media, 3 different types of liquid culture medium including macro concentrations of MS, SH and B5 were examined, and the results showed that there is a significant difference between the culture media in terms of biomass production. Regarding valerenic acid content, the highest amount (about 0.58 mg/g dry weight of hairy root) belonged to MSU line in ½ SH culture medium. Comparison of the mean effect of time and elicitor showed that the highest valerenic acid content was obtained from 6-day treatment with methyl Jasmonate (0.6 mg/g dry root weight) and 10-day calcium treatment (0.53 mg / g dry root weight). The lowest level of valerenic acid was observed at 12 days with chitosan elicitor (0.14 mg/g dry root weight).
آدرس ثابت

پیشنهاد خرید
پیوستها
عنوان :
نام فایل :
نوع عام محتوا :
نوع ماده :
فرمت :
سایز :
عرض :
طول :
نظرسنجی