|
" بيان باكتريايي ژن نوتركيب پروتئين پوششي ويروس هاي مندرج در استانداردهاي ملي سلامت سيب زميني به منظور توليد آنتي¬بادي اختصاصي "
نادرپور، مسعود
| شماره شناسایی
|
:
|
18874412
|
| شماره مدرک
|
:
|
۶۱۷۵۷
|
| نام عام مواد
|
:
|
[گزارش نهایی -تجاری]
|
| شناسه افزوده
|
:
|
نادرپور، مسعود
|
|
|
:
|
صفي خاني، فضل اله
|
|
|
:
|
عصاره، محمد حسن
|
|
|
:
|
نادرپور، مسعود
|
| عنوان اصلي
|
:
|
بيان باكتريايي ژن نوتركيب پروتئين پوششي ويروس هاي مندرج در استانداردهاي ملي سلامت سيب زميني به منظور توليد آنتي¬بادي اختصاصي
|
| نام نخستين پديدآور
|
:
|
نادرپور، مسعود
|
| عنوان اصلي به زبان ديگر
|
:
|
Bacterial expression of recombinant coat protein gene of potato viruses for specific antibody production
|
| وضعیت انتشار
|
:
|
کرج: موسسه تحقيقات ثبت و گواهي بذر و نهال، ۱۴۰۱
|
| فروست
|
:
|
شماره ثبت ۶۱۷۵۷ مورخ ۱۴۰۱/۰۴/۰۲۶۱۷۵۷
|
|
|
:
|
شماره طرح : 14-08-08-9451
|
|
|
:
|
سامانه سمپات
|
| توصیفگر
|
:
|
ویروس
|
|
|
:
|
سیب زمینی
|
|
|
:
|
بیان ژن
|
|
|
:
|
پروتئین نوترکیب دناتوره و طبیعی
|
|
|
:
|
آنتی¬بادی نوترکیب
|
| خلاصه یا چکیده
|
:
|
وجود بیمارگرهای گیاهی بویژه ویروس ها در بذور سیب زمینی مهمترین فاکتور تولیداین محصول بشمار می آید. به دلیل تکثیر غیرجنسی سیب زمینی و انتقال مستقیم بیمارگرها به نتاج، تاثیر آنها بویژه ویروس ها در پدیده اضمحلال (دژنراسیون) بذر سیب زمینی، انتقال تعدادی از آنها با ناقلین بیولوژیکی و بالاخره،اهمیت جهانی این محصول، بیمارگرهای گیاهی را به مانعی عمده در تجارت آن تبدل کرده است. با توجه به عدم وجود روش های موثر مبارزه با ویروس ها در سطح کاربردی، پیشگیری از ورود این عوامل به زراعت سیب زمینی با استفاده از بذور سالم، حذف منابع آلوده و کنترل ناقلین بیولوژیکی موثرترین روش مبارزه با این عوامل محسوب می شود. به هر حال، همه روش های فوق بر مبنای شناسایی ویروس ها استوار است. با وجود روش های مختلف در ردیابی ویروس ها، روش های سرولوژیکی از نظر دقت، هزینه و زمان ارائه نتایج بویژه در پست های قرنطینه ای و ارگان های گواهی بذور سیب زمینی همچنان به عنوان کاربردی ترین روش ها مطرح است. به هر حال، آزمون های سرولوژیکی به آنتی بادی های اختصاصی هر ویروس و شاهدهای مثبت و منفی آنها نیازمند است. این مواد بیولوژیک به طور اختصاصی توسط شرکت های بزرگ در غرب تهیه و به کشورهای متقاضی صادر می شود. موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال، بزرگترین نهاد کشور در استفاده از آنتی بادی های اختصاصی ویروس های گیاهی از جمله Potato virus Y Potyvirus (PVY)، Potato virus A Potyvirus (PVA)، Potato virus S Carlavirus (PVS)، Potato viru M Carlavirus (PVM)، Potato virus X Potexvirus (PVX) وPotato leafroll Poleovirus (PLRV) برای گواهی بذر سیب زمینی بوده و علاوه بر مشکلات دیگر در مسیر تامین آنها، سالیانه هزینه هنگفتی برای تهیه این مواد متحمل می شود. به علاوه، آنتی بادی های وارداتی به دلیل تولید بر اساس خصوصیات فیزیکوشیمیایی جدایه های غیربومی، از دقت ناکافی در برخی موارد برخوردار هستند.
در تحقیق حاضر تلاش شد تا با تکیه بر فناوری DNA نوترکیب و بیان ژن پروتئین پوششی جدایه های¬ غالب ویروس های فوق در ایران، آنتی¬بادی های چندهمسانه¬ای برای استفاده در گواهی سلامت بذور سیب زمینی تولید شود. برای دستیابی به جدایه (هایی) از ویروس های فوق که در کشور به طور گسترده شیوع دارند، ابتدا از مناطق عمده تولید سیب زمینی (بذری و خوراکی) در فاصله سال¬های 98-93 نمونه برداری انجام و در مجموع 871 نمونه گیاهی مشکوک به آلودگی ویروسی یا بدون علائم از مزارع سیب زمینی استان¬های خراسان رضوی، اصفهان، کرمانشاه، همدان، مرکزی، هرمزگان، خوزستان، کرمان و اردبیل جمع¬آوری شد. علائم بیماری روی بوته های مشکوک اغلب شامل موزاییک، زردی، ابلقی، بدشکلی برگ، کوتاه ماندن بوته و تورم های سبز بود. تمام نمونه ها پس از انتقال به آزمایشگاه در روی یخ و فراوری اولیه، با استفاده از روش سرولوژیک الایزا از نظر آلودگی به PVY، PVA، PVS، PVM،PVX و PLRV با آنتی بادی های اختصاصی خریداری شده از شرکت Agdia (USA) بررسی شدند. آلودگی به ویروس های فوق به ترتیب در 211، 14، 49، 29، 34 و173 نمونه ردیابی شد. به هر حال در آزمون های RT-PCR آلودگی به PVS، PVA و PVM به ترتیب در 6، 4 و 3 نمونه تایید شد. نتایج توالی‌یابی، تشابه بیش از 98 درصد بین توالی های حاصل با توالی های منتشر شده برای آن ویروس ها را نشان داد. بر اساس توالی های ناحیه ژن پروتئین پوششی (CP) جدایه های مربوط به هر ویروس، یک جدایه غالب (در مورد PVY دو جدایه) انتخاب و برای بیان در سیستم باکتریایی مورد استفاده قرار گرفت. ژن های پروتئین پوششی جدایه های غالب با استفاده از آنزیم pfu تکثیر و پس از خالص سازی، در حامل همسانه¬سازی pJET1.2/Blunt یا pTG-19 الحاق و با استفاده از روش شوک حرارتی به باکتری Escherichia coli سویه DH5α یا XL1-Blue منتقل شدند. جهت بیان پروتئین به صورت نوترکیب، قطعات با استفاده از هضم آنزیمی با آنزیم های مهندسی شده برای نواحی 5’ و 3’ ژن CP (PVY: BamHI/HindIII، PVS; PVA: SacI/HindIII،PVM: HindIII/XhoI و PLRV: BamHI/KpnI) از وکتور همسانه¬سازی جدا شده و قطعه مربوط به ژن پروتئین پوششی ویروس ها به حامل های بیان (PVY; PVA: pQE30وPLRV; PVX; PVM; PVS: pET28a)متصل گردید. برای بیان پروتئین های پوششی، وکتورهای نوترکیب به سویه بیانی مناسب از باکتری E.coli M15 (PVY, PVA) یا E. coli BL21-DE3 (PVX, PVM, PVX, PLRV) انتقال داده شد. یک کلونی منفرد از هر باکتری تراریخت شده انتخاب و بیان پروتئین¬ نوترکیب با استفاده از ماده IPTG القاء شد. مشاهده باندهای با غلظت بالا به اندازه های حدود 40 (PVM)، 36 (PVS, PVA, PVX)،35 (PVY) و 28 (PLRV) کیلو دالتون در ژل اکریل آمید نشان دهنده حصول پروتئین های نوترکیب از سیستم های باکتریایی بود. القاء بیان با غلظت ها و مدت زمان های انکوباسیون مناسب (PVY, PVS, PLRV: 1 mM/4h; PVM: 2 mM/5h; PVA: 1-2 mM/6h; PVX: 1 mM/7h) بهترین بیان را برای ژن پروتئین پوششی نوترکیب ویروس ها نشان داد. پس از بهینه¬سازی بیان و تایید آن با استفاده از آزمون¬های لکه¬گذاری وسترن و داس-الایزا، پروتئین های پوششی نوترکیب (بجز PLRVcp) به دو صورت طبیعی و دناتوره در حجم بالا از باکتری تراریخت شده جداسازی و تخلیص شد. یک خرگوش با استفاده از مخلوط پروتئین‌های نوترکیب طبیعی و دناتوره (PVY, PVX, PVM)، فقط طبیعی (PLRV)، طبیعی، دناتوره و مخلوط طبیعی-دناتوره (PVS, PVA) تزریق شد. آنتی¬سرم های به دست آمده در هر مورد، از خون خرگوش¬ با استفاده از آزمون¬ PTA-ELISA بررسی و تایید شد. خالص¬سازی آنتی¬بادی ها از آنتی¬سرم ها انجام و پس از تیتر سنجی ، برای ردیابی ویروس های مرتبط در آزمون¬های DAS-ELISA و PTA-ELISA مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج آزمون¬های سرولوژیکی تیتر مناسب، دقت بالا و کاملا اختصاصی آنتی¬بادی های¬ تهیه شده را نشان داد. آنتی¬بادی های تولید شده به نسبت آنتی¬بادی های تجاری اگدیا نیز مقایسه و در پوشش دهی چاهک¬ها با رقت برابر 1:200 جذب نوری به مراتب مناسب‌تری نشان دادند. این نخستین گزارش از تهیه آنتی¬بادی های نوترکیب با استفاده از بیان ژن پوشش پروتئینی ویروس ها برای استفاده در سطوح کاربردی و آنتی بادی های PVX ،PVY ،PVA و PVM در سطوح تحقیقاتی و کاربردی در کشور است.
|
|
|
:
|
Plant diseases and in particular, viruses are the main factors affecting potato seed production. Vegetatively propagation of potatoes and easily transmission of viruses to next generation, as well as transmission of some of those viruses by insect vectors, have made viruses the most important battles for potato production worldwide. As no effective control measures are known to combat viruses, prevetion of infection by using certified seeds, chemical control of insect vectors and rouging of infection sources are the only applied means for plant production. However, all those control approaches rely on virus detection that is routinely done using several serological and or molecular assays. Indeed, serological assays are very applicable in virus detection in terms of sensitivity, cost and time to achieve results. However, these assays demand virus-specific antibodies and negative and positive controls that are totally imported from overseas.Seed and Plant Certification and Registration Research Institute is one of the public sectors that certify huge number of potato seed samples annually for Potato virus Y (PVY), Potato leafroll virus (PLRV), Potato virus A (PVA), Potato virus M (PVM), Potato virus S (PVS) and Potato virus X (PVX). Commercial preparation of specific antibodies for all those viruses are very expensive and laborious. Additionally, in some cases those antibodies show low specificity with endemic isolates.
Production of polyclonal antibodies against PVY, PLRV, PVA, PVM, PVS and PVX were the objectives of the present study. Sampling of potato leaves suspicious of virus infection and symptomless plants were carried out from the major potato production areas in Khorasan Razavi, Esfahan, Kermanshah, Hamedan, Markazi, Hormozqan, Khouzestan, Kerman and Ardebil within the growing seasons of 2015-2019. A total of 871 samples were collected to analyze the most prevalent isolates of each virus. Samples were tested by DAS-ELISA for all six viruses using commercial antibodies purchased for the Agdia, USA. In total 211, 14, 49, 29, 34 and 173 samples were found to be infected by PVY, PVA, PVS, PVM, PVX and PLRV, respectively. However, RT-PCR assays revealed that only 6, 4 and 3 samples are infected by PVS, PVA and PVM, respectively. Sequencing data showed high similarity (over 98%) among Iranian viral isolates and those published in NCBI. Additionally, these data showed that PVY is presents in two distinct isolate groups whereas the other viruses presented in just one isolate. The coat protein (CP) gene of all selected isolates were amplified by pfu DNA polymerase and subsequently cloned in pJET1.2/Blunt vector. Cloning were done in Escherichia coli DH5α. According to virus sequences, two primers were designed for each virus carrying a restriction site on its 5' end to facilitate the insertion of viral CP sequences into the expression vectors. According to the expression vectors (pET28a or pQE30), the E. coli strains BL21 (DE3) and M15 were used respectively as the best expression hosts under IPTG induction. The best protein expression was optimized with 1-2 mM IPTG and for 4-7 hours incubation. The expression of viral CP genes were confirmed by SDS-PAGE, western blotting and DAS-ELISA. The recombinant CP proteins of PVY, PVM, PVA, PVS and PVX were extracted under native and denatured conditions. The mixture of native and denatured proteins were used for antibody production against PVM, PVX and PVY, whereas native, denatured and native-denatured mixtures were used for PVA and PVS and only denatured CP was used for PLRV antibody production. The specificity of released antibodies were checked by DAS-ELISA and PTA-ELISA and their optimal titres were adjusted for routine testing of potato samples. Comparison assays with commercial antibodies revealed more specificity of native antibodies as expected. To our knowledge, this is the first report on application of recombinant antibody for routine laboratory assays in certification schemes of potato seeds.
|
| |