بررسی ایمنی زایی پروتئین نوترکیب )الحاقی( دوگانه با توان آنتی ژنی از بخش های سم آلفای کلستریدیوم نووئی و سم اپسیلون کلستریدیوم پرفرنژنس در مدل حیوان آزمایشگاهی

مرکز فناوری اطلاعات و اطلاع رسانی کشاورزی

منو

" بررسی ایمنی زایی پروتئین نوترکیب )الحاقی( دوگانه با توان آنتی ژنی از بخش های سم آلفای کلستریدیوم نووئی و سم اپسیلون کلستریدیوم پرفرنژنس در مدل حیوان آزمایشگاهی "

نوع مدرک	:	پایان نامه فارسی
زبان مدرک	:	فارسی
شماره رکورد	:	18873845
شماره مدرک	:	۸۰-۵۹۴۹
سرشناسه	:	مهرورز، ، محسن‏
عنوان	:	بررسی ایمنی زایی پروتئین نوترکیب )الحاقی( دوگانه با توان آنتی ژنی از بخش های سم آلفای کلستریدیوم نووئی و سم اپسیلون کلستریدیوم پرفرنژنس در مدل حیوان آزمایشگاهی
مقطع تحصیلی	:	دکترای تخصصی
رشته تحصیلی	:	زیست فناوری
چکيده	:	کلستریدیومها باسیلهای اسپور داری می باشند که به فراوانی در محیط اطراف ما موجود بوده و علی رغم اینکه عمدتاساپروفیت هستند، نقش بسیار مهمی در سلامت، بهداشت غذایی و اقتصاد دامپروری دارند. عمده فعالیت این باکتریهابه واسطه توکسین های ترشحی آنها صورت میپذیرد. آلودگی به کلستریدیومهای پرفرنژنس و نووئی میتواند منجر بهقانقاریا ، انتریت نکروتیک،بیماری سیاه و سایر بیماری های روده ای و انتروتاکسمیک در انسان و یا حیوان شود. از اینرو مطالعه ی توکسین های آنها از اهمیت زیادی برخوردار است . بررسی های ایمونولوژیکی در کنار مطالعات بیوانفورماتیک نشان داده است که می توان با استفاده از قسمت های خاص ایمونوژن از یک آنتی ژن، که خاصیت آنتیژنسیته ی بالا دارد ، سیستم ایمنی را علیه آنتی ژن تحریک کرد.هدف از این مطالعه به کارگیری ترکیبی از روش های بیوانفورماتیک، زیست شناسی مولکولی و ایمونولوژیک ، به منظورتهیه ی فیوژن پروتئینی متشکل از نواحی با آنتی ژنیسیتهی بالا از توکسین آلفای کلستریدیوم نووئی و توکسین اپسیلونکلستریدیوم پرفرنژنس و تهیه پروتئین نوترکیب دو گانه و بررسی خواص و ویژگی های ایمونوژنیک آن می باشد.برای این منظور ابتدا قطعات با آنتی ژنسیته ی بالا براساس مطالعات بیوانفورماتیکی هر کدام از پروتئین ها شناسایی وانتخاب شده و پرایمرها و لینکر اختصاصی به منظور تکثیر و اتصال این قطعات طراحی گردید. قطعات تکثیر شده دروکتور کلونینگ pTZ57R/T وارد و سپس در وکتور بیانی pET28a(+) کلون گردیدند. پلاسمید حاوی قطعه بهوسیلهی PCR تایید شد. پس از بیان پروتئین نوترکیب، پلاسمید حاوی ژن قطعات مزبور با استفاده از آنزیم های برشیخاص برش داده شدند و قطعات به وسیله لینکر به هم متصل گردیدند. قطعه فیوژن ساخته شده مجددا ابتدا در وکتورکلونینگ pTZ57R/T و پس از تکثیر در وکتور بیانی pET28a(+) کلون گردید. پپتید فیوژن پس از بیان در سلولبیانی E.coli BL21(DE3) با استفاده از سولفات آمونیوم رسوب داده شد و به وسیله کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلینیمه خالص گردید خصوصیات آ نتی ژنیک پروتئین مزبور با آزمون های )دات بلات، وسترن بلات و الایزا( تایید گردید.سپس به منظور بررسی ایمونوژنسیته، پروتئین به حیوان آزمایشگاهی تزریق گردید و سرم حیوان با هدف انجام واکنشمتقاطع با توکسین و پروتئین نوترکیب جمع آوری گردید. نتیجه ی آزمون های ایمونولوژی آنتی بادی تولید شده برعلیه پروتئین نوترکیب، میل ترکیبی بالایی را در مقایسه با توکسین طبیعی نشان داد. به نظر می رسد، روش های برپایهی بیوانفورماتیک می تواند احتمال انتخاب قطعاتی با پتانسیل بالای ایمونوژنسیته را افزایش دهند. پپتید ساختهشده و آنتی بادی حاصل از آن ابزار بسیار مناسبی برای تولید کیت های تشخیصی شناسایی عامل دو بیماری یاد شدهو همچنین کاندیدی جهت ایجاد ایمنی در دام در صورت ادامه تحقیقات و انجام مطالعات بیشتر می باشد
	:	Clostridiums are spore bacillus that live in our environment (in abundance). They are saprophyte but have very important role in social Health, Food Health and Animal husbandry economics. The major activity of these bacteria is due to their secreted toxins. Contamination with clostridium preferingenis and novyi my causes gangrene, Necrotic Enteritis, Black Disease or other Intestinal and enterotoxaemia diseases in humans or animals. So studying their toxins is very important. Immunologic and Bioinformatic researches shows (that) by using specific immunogen peptide of an antigen that has high antigenicity can stimulate the immune system against the antigen.In this study, we try to clone and express a fusion peptide of C.perfringens epsilon (toxin) and C.novyi alpha toxin(s) high antigenic fragments by using a combination of bioinformatics, molecular biology and immunoligic methods and study its immunologic affects.Method: The high fragments were selected based on bioinformatics study, Then Specific primers and linker were designed. We used primers for amplification of the regions. The amplified fragments were inserted into cloning (pTZ57R/T) and expression (pET28a(+)) vectors. Positive clones was confirmed by the PCR. Each fragments were digested and ligated by linker peptide. The fusion fragment was cloned into expression vector and then transformed into E.coli BL21 (DE3). The fusion protein was then expressed and detected by ELISA and Western Blotting and was purified using ammonium sulphate and gel filtration chromatography. The purification of the recombinant protein was evaluated by spectrophotometry, ELISA, Western blot and Dot blot. Then was used for animal immunization. The serum was used for cross -reaction with toxin and recombinant antigen. Injection was repeated every 14th days for three times. Serum was collected and tested for the presence of specific antibodies against fusion protein.Results: The cloning step was verified using PCR and plasmid digestion. The results of immunological tests showed that the recombinant fusion protein has both antigenic properties. The fusion protein was purified and the rabbit serum showed positive reaction with the recombinant fusion protein and epsilon and alpha toxins as well.Conclusion: The results were indicated that the designed fusion protein was able to stimulate effective immune responses against both alpha and epsilon toxins. The fusion protein obtained from current study can be examined as a vaccine candidate against entrotoxemia and black disease.
توصیفگر	:	کلستریدیوم پرفرنژنس
	:	کلستریدیوم نووئی
	:	آلفا توکسین
شناسه افزوده	:	فتحی نجفی‏ ، محسن‏
عنوان ديگر	:	An investigation on immunization of bifunctional antigenic recombinant (fusion) protein of clostridium novyi alpha toxin and clostridium perfringens epsilon toxin in animal model.