|
" بیان ژن پروتئین پوششی ویروس ای سیب زمینی (Potato virus A Potyvirus) در باکتری Escherichia coli و تولید آنتی بادی چند همسانه ای اختصاصی علیه ویروس "
| شماره شناسایی
|
:
|
18867915
|
| شماره مدرک
|
:
|
۵۹۷۹۵
|
| نام عام مواد
|
:
|
[گزارش نهایی -تجاری]
|
| شناسه افزوده
|
:
|
عصاره، محمد حسن
|
|
|
:
|
نادرپور، مسعود
|
|
|
:
|
شهبازی، راحله
|
|
|
:
|
رستمی، افشین
|
|
|
:
|
حسینی فر، امید
|
| عنوان اصلي
|
:
|
بیان ژن پروتئین پوششی ویروس ای سیب زمینی (Potato virus A Potyvirus) در باکتری Escherichia coli و تولید آنتی بادی چند همسانه ای اختصاصی علیه ویروس
|
| عنوان اصلي به زبان ديگر
|
:
|
Bacterial expression of potato viruses coat proteins in Escherichia coli and production of recombinant polyclonal antibodies.
|
| صفحه شمار
|
:
|
۱۹ص.: مصور، رنگی، جدول،
|
| وضعیت انتشار
|
:
|
کرج: موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر، ۱۴۰۰
|
| فروست
|
:
|
شماره ثبت۵۹۷۹۵مورخه۱۴۰۰/۴/۲۵۹۷۹۵
|
|
|
:
|
شماره طرح: ۹۷۰۶۵۴-۰۹۴۵۱-۰۰۹-۰۸-۰۸-۱۲۴
|
|
|
:
|
شماره نامه: سامانه سمپات،
|
|
|
:
|
عنوان طرح: تجاری است
|
| خلاصه یا چکیده
|
:
|
ویروس ای سیب زمینی (Potato virus A, PVA) از مهمترین ویروس های بیماریزا در گیاه سیب زمینی بوده و یکی از عوامل تاثیرگذار در دژنراسیون این محصول محسوب می شود. بدلیل عدم وجود روش موثر در کنترل ویروس ها، استفاده از مواد تکثیری (بذر، نهال، ...)سالم، حذف منابع الوده و مبارزه با ناقلین بیولوژیکی، تنها گزینه کاربردی در پیشگیری از بروز و شیوع بیماری های ویروسی بوده و بنابراین، مستلزم شناسایی و ردیابی آنها در بذر و نهال است. آزمون های سرولوژيكي با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی، به دليل دارا بودن ویژگی های مناسب در ردیابی ویروس های گیاهی، از ديرباز مورد توجه پژوهش گران بوده است. از این رو، تولید آنتی بادی با استفاده از ژن پروتئین پوششی بیان شده در یک سیستم مناسب می تواند یک راه حل منطقی برای تولید آنتی بادی مورد استفاده در آزمون های سرولوژیک باشد. در تحقیق حاضر، تلاش شده تا بیان ژن پروتئین پوششی جدایه ی غالب ویروس ای سیب‌زمینی در ایران، برای تولید آنتی بادی چندهمسانه¬ای مورد استفاده قرار گیرد. طی نمونه برداری های انجام شده، در مجموع تعداد 471 نمونه گیاهی سیب-زمینی مشکوک به آلودگی ویروسی از مزارع استان های اردبیل ، هرمزگان و کرمان جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل شد و با استفاده از روش سرولوژیک الایزا برای ردیابی این ویروس مورد ارزیابی قرار گرفتند. در مجموع 14 جدایه از ویروس ای سیب‌زمینی در نمونه ها ردیابی شد. نتایج توالی‌یابی داده‌های نوکلئوتیدی حاکی از این بود که توالیهای مورد بررسی با درصد تشابه تا 98 درصد به ویروس مربوطه شباهت داشتند. ژن پروتئین پوششی جدایه غالب این ویروس با استفاده از آنزیم pfu تکثیر و قطعات تکثیر شده با استفاده از کیت تجاری Vivantis از ژل آگارز خالصسازی شد. قطعات DNA خالص شده با استفاده از واکنش اتصال به حامل همسانه سازی pJET1.2/Blunt الحاق و با استفاده از روش شوک حرارتی به باکتری Escherichia coli سویه DH5α منتقل شد. برای بیان پروتئین به صورت نوترکیب، قطعات با استفاده از هضم آنزیمی از وکتور همسانه سازی جدا شده و قطعه مربوط به ژن پروتئین پوششی ویروس ای سیب زمینی به حامل بیان pQE-30 متصل و به سویه بیانی مناسب از باکتری E.coli (سویه M15 برای وکتور pQE30-PVAcp) انتقال داده شد. یک کلونی منفرد از هر باکتری تراریخت شده انتخاب و بیان پروتئین نوترکیب با روش القاء بیان با استفاده از ماده IPTG انجام شد. مشاهده باندهای با غلظت بالا به اندازه های حدود 36 کیلو دالتون برای ویروس ای سیب زمینی در ژل اکریل آمید نشان دهنده حصول پروتئین از سیستم باکتری بود. القاء بیان با غلظت 1 و 2 میلی مولار از IPTG و به مدت 6 ساعت بهترین بیان برای ویروس ای سیب زمینی در سازه مورد اشاره را نشان داد. پس از بهینه سازی بیان و تایید آن با استفاده از آزمون های لکه گذاری وسترن و داس-الایزا، پروتئین پوششی نوترکیب به دو صورت طبیعی و دناتوره در حجم بالا از باکتری تراریخت شده جداسازی و تخلیص شد. سه خرگوش به ترتیب با استفاده از پروتئین نوترکیب طبیعی، پروتئین نوترکیب دناتوره و مخلوط دو پروتئین طبیعی و دناتوره تزریق شدند. آنتی سرم های به دست آمده از خون خرگوش ها با استفاده از آزمون PTA-ELISA مورد بررسی و تایید قرار گرفت. خالص سازی آنتی بادی ها از آنتی سرم ها انجام شده و پس از تعیین تیتر هر یک از سه آنتی بادی تولیدی، برای ردیابی PVA در آزمون های DAS-ELISA و PTA-ELISA بررسی شدند. نتایج آزمون های سرولوژیکی نشان از تیتر مناسب، دقت بالا و اختصاصیت بسیارخوب آنتی بادی های تهیه شده داشت. دو آنتی بادی دناتوره و مخلوط نسبت به آنتی بادی طبیعی تیتر بالاتری داشتند. بعلاوه، آنتی بادی‌های تولید شده با آنتی بادی تجاری اگدیا (آمریکا) نیز مقایسه و در پوشش دهی چاهک ها با رقت برابر 1:200 جذب نوری به مراتب مناسب‌تری از خود نشان دادند. این نخستین گزارش تهیه آنتی بادی نوترکیب با استفاده از بیان ژن پوشش پروتئینی ویروس ای سیب‌زمینی در کشور است.واژه های کلیدی: ویروس ای سیب زمینی، بیان ژن، آنتی بادی نوترکیب، پروتئین نوترکیب دناتوره و طبیعی.
|
|
|
:
|
Potato virus A (PVA) is among the major viral pathogens of potato and is responsible for a phenomenon called “degeneration” in potato. Due to the lack of efficient and applied control measure to combat viral diseases in plants, the usage of virus-free planting materials, rouging of primary infection sources and insecticides to control viral vectors are amongest the useful measures to prevent viral incidence and distribution. However, accurate detection of viruses in planting materials is vital to develope any control measure. Serological assays using virus-specific antibodies are the most practical approaches for virus detection in planting materials. However, antibody production using classical methods make battles for the assays. Therefore, production of antibody using heterologously expressed recombinant virus coat protein, can be an appropriate solution for antibody production. The present study, focused on production of polyclonal antibody against PVA by expression of recombinant coat protein (CP) of virus in bacterial systems. During summer 2016-2018, a total of 471 potato leaf samples suspicious of viral contamination or apparently healthy plants were collected from the potato growing fields of Ardebil, Hormozgan and Kerman provinces. All samples were transferred to Seed and Plant Certification and Registration Research Institute laboratory and analyzed by Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using PVA- specific antibodies (Agdia, USA). A total of 14 isolates of PVA was detected accordingly. RNA was extracted from all virus positive samples and was checked by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using specific primers designed based on published sequences of PVA-CP. Four out of 14 samples showed positive results for PVA. The amplified CP fragments from all positive samples were sequenced. The CP genes of the dominant strains of PVA was then amplified using pfu DNA polymerase and purified from agarose gel using commercial gel extraction kit and sequenced. The purified DNA fragments were inserted into cloning vector pJET1/2 Blunt according to the manufacturer's instruction and cloned into Escherichia coli XL1Blue strain. Bacterial colonies were evaluated for PVAcp DNAs. Following plasmid extraction and sequencing, the DNA fragment and expression vector (pQE-30) were digested with appropriate restriction nucleases, ligated and transformed into appropriate protein expression strain of E. coli (M15). Single colonies of transgenic bacteria were selected to express recombinant PVAcp proteins using Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) as expression inducer. Vertical electrophoresis in acryl amide gel (SDS-PAGE) was used to detect the recombinant proteins extracted from bacteria. The result showed successful expression of the 36 KDa recombinant protein related to PVAcp. Induction of protein expression by 1 and 2 mM IPTG for 6 hours resulted in the best expression for PVAcp in this construct. The recombinant proteins were purified in native and denatured forms and were finally confirmed by western bloting and DAS-ELISA. The proteins were injected four times to individual rabbits by 8 days intervals. Finally, rabbits were blooded and the antisera were extracted. The specific Imunoglobulins were purified from all three different PVA antisera and were tested in PTA-ELISA and DAS-ELISA assayes for PVA detection. All serological tests showed appropriate titres, high accuracy and excellent specificity of the prepared antibodies in PVA detection. Antibody achieved from denatured and mixed protein showed better titration than antibody released against native form of protein. Comparison of the antibodies with commercial antibody from the the Agdia (USA) revealed higher specificity of native antibodies. To the author′s knowledge, this is the first report in the gene expression of PVA coat protein in Iran and preparation of thire counter part antibody for practical purposes.Key words: Potato virus A, gene expression, recombinant antibody, SDS-PAGE.
|
| |