|
" جداسازی و تخلیص پروتئین‌هايESAT-6 و CFP-10 از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سويه C "
| شماره شناسایی
|
:
|
18842767
|
| شماره مدرک
|
:
|
۵۴۴۹۲
|
| نام عام مواد
|
:
|
[گزارش نهایی -ویژه]
|
| شناسه افزوده
|
:
|
مژگانی، ناهید
|
|
|
:
|
مصوری، نادر
|
|
|
:
|
عارف‌پزوهی، رضا
|
|
|
:
|
سلیمانی، کیومرث
|
|
|
:
|
سجادی، حسن
|
|
|
:
|
شکیبامهر، نفیسه
|
|
|
:
|
محمدطاهری، محمد
|
|
|
:
|
زارع، عباس
|
| عنوان اصلي
|
:
|
جداسازی و تخلیص پروتئین‌هايESAT-6 و CFP-10 از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سويه C
|
| عنوان اصلي به زبان ديگر
|
:
|
:Isolation and purification of ESAT-6 and CFP-10 proteins from Mycobacterium tuberculosis strain C
|
| صفحه شمار
|
:
|
۶۵ ص.:مصور، جدول، نمودار
|
| وضعیت انتشار
|
:
|
کرج: موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، ۱۳۹۷
|
| فروست
|
:
|
شماره ثبت ۵۴۴۹۲ مورخ ۱۳۹۷/۰۸/۲۱
|
|
|
:
|
شماره طرح ۹۴۱۲۷-۱۸-۱۸-۲
|
|
|
:
|
این طرح: ترویجی است
|
|
|
:
|
دستاورد بر حسب ماهیت: یافته‌های تحقیقاتی اثر بخش است
|
|
|
:
|
انتشار در قالب: مقالات علمی-پژوهشی داخلی و خارجی
|
|
|
:
|
۵۴۴۹۲
|
| خلاصه یا چکیده
|
:
|
سل یکی از مهمترین تهدیدات بهداشت جهان محسوب می‌شود. بیشتر از 80% بیماران دچار سل در کشورهای در حال توسعه هستند. در حال حاضر تست مانتو (تست تزریق توبرکولین)، يكي از روش‌هاي تشخیصي بیماری سل و شناسايي عفونت با مايكوباكتريوم‌ها است. بررسي ايمني بر عليه اين بيماري بر اساس تشخیص ازدیاد حساسیت تاخیری (DTH) القاء شده توسط فرآورده خالص پروتئینی میکروب سل (PPD) می‌باشد. متاسفانه در كشور ايران به دلیل فراواني عفونت با انواع مايكوباكتريوم‌ها و تزريق واكسنBCG در بدو تولد اين روش از ويژگي پاييني برخوردار است و جهت تشخيص دقيق بيماري سل، اين تست کمتر استفاده می‌شود و به اجبار مي‌بايست از تست‌هاي پر هزينه مانند كوانتي فرون TB به جاي آن استفاده نمود. به علت بالا بودن هزینه تخلیص پروتئین طبیعی و حجم کم بدست آمده از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس پروتئین فوق به صورت نوترکیب تولید و تخلیص می‌شود. در این تحقیق هدف تخلیص و جداسازی پروتئین‌های ESAT-6 و CFP-10 به صورت طبیعی بوده، زیرا پروتئین های نوترکیب قابلیت‌های پروتئین‌های طبیعی را ندارند همچنین این پروتئین‌ها مي‌توانند جايگزين مناسبي براي تست توبرکولین باشند. در این تحقیق، پروتئین‌هاي ESAT-6 و CFP-10 (با وزن مولكولي حدود 10 كيلودالتون) مترشحه در محيط كشت باكتري مايكوباكتريوم توبركلوزيس خالص‌سازی شدند. برای تخلیص کمپلکس پروتئینی CFP10/ESAT-6 از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سویه C موجود در بخش توبرکولین موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی در محیط کشت جامد لوین اشتاین-جانسون گلیسرین‌دار کشت داده شد سپس برای عادت دادن سویه‌ها به محیط مایع دورسه هنلی از محیط‌های دو فازی مایع و جامد استفاده شد و پس از آن باکتری به محیط مایع دورسه هنلی منتقل گردید. پس از 6 هفته رشد، باکتری‌ها با حرارت دادن در 68 و 120 درجه سانتی‌گراد به مدت 90 دقیقه غیر فعال شدند. محیط مایع حاوی پروتئین‌های ترشحی توسط فیلترهای ۰/۲ میکرومتر تصفیه و برای جداسازی پروتئین‌های محلول در محیط کشت ترسیب توسط TCA و سولفات آمونیوم انجام گرفت. غلظت پروتئین‌های ترسیب شده با روش لوری و وزن تقریبی پروتئین‌ها توسط SDS-PAGE تعیین گردید. نتایج نشان داد که ترسیب با سولفات آمونیوم در مایع کشت بدست آمده پس از غیر فعال سازی در 68 درجه سانتی‌گراد بهتر از ترسیب با TCA و غیر فعال سازی 120 درجه‌سانتی گراد می باشد. در نمونه های ترسیب شده با TCA باندهای غیر اختصاصی بیشتری نسبت به نمونه های ترسیب شده با سولفات آمونیوم مشاهده گردید. پس از ترسیب با سولفات آمونیوم، کمپلکس پروتئینی CFP10/ESAT-6 ترشحی توسط کروماتوگرافی ژلی جداسازی شدند. پروتئین‌های خالص‌سازی شده با کمک الکتروفورز SDS-PAGE بررسی و غلظت پروتئین با روش لوری مجددا اندازه گیری شد. سپس کمپلکس پروتئینی CFP10/ESAT-6 با استفاده از آنتی‌بادی ESAT-6 با روش الکتروفورز وسترن بلات تاييد گردید و با سیستم الایزای طراحی شده در بخش تحقیق و تهیه توبرکولین و مالئین و آزمایشگاه رفرانس سل دامی مورد ارزیابی قرار گرفت. واژه‌هاي كليدي: مايكوباكتريوم توبركلوزيس، PPD، CFP-10، ESAT-6، سولفات آمونیوم، ژل کروماتوگرافی، الکتروفورز، وسترن بلات
|
|
|
:
|
Currently, one of the diagnostic methods for diagnosing TB and detecting mycobacterium infection and also for analyzing immunity against this disease is the well-known Mantoux test. This test is based on the delayed sensitivity (DTH) induced by the purified protein fractions of the mycobacterium cultures (PPD). Unfortunately, in Iran due to high frequency of infection with different types of mycobacteria and vaccination of BCG vaccine at birth, this method has a low sensitivity and false positive may arise. Thus, the use of Mantoux tests for accurate identification of TB disease has been limited and it is imperative to use other tests such as QuantiFERON-TB (QFT). QFT is an interferon-gamma (IFN-γ) release assay, commonly known as an IGRA, and is a modern alternative to the tuberculin skin test (TST, PPD or Mantoux). However, one of the main drawbacks for the use of QFT is its cost which hinders its use in all labs routinely. In order to overcome these hurdles, the best solution is to use purified protein derivatives and to optimize protocols for economical production of high amount of proteins. ESAT-6 (6-kDa early secretory antigenic target) and CFP-10 (10-kDa culture filtrate protein) have been described as dominant antigens recognized by T-cells and considered as virulence factors in Mycobacterium tuberculosis. In this research we aimed to purify ESAT-6/CFP-10 protein complex from M.tuberculosis strain C strain which are natural proteins and more economical then the recombinant proteins.The mentioned bacterial strain was grown in Lowenstein-Jensen solid medium and then transferred to a Dorset-Henley liquid medium for a period of 4-6 weeks. The bacterial cultures were inactivated at 68ºC and 120ºC for a period of 90 and 180 min, filtered and precipitated with different concentrations of Ammonium sulphate. The precipitated protein fractions were collected via centrifugation, concentrated using PEG and dialyzed. The protein concentrations were determined by Lowry method and approximate molecular weight of the purified fractions determined by SDS-PAGE analysis. The purified fractions were subjected to gel chromatography using Sephadex G-50 columns. Finally the purified protein fractions were verified using ESAT6 specific antibodies by Western blotting technique. The purified fractions showed presence of approximately 10KDa band during SDS PAGE analysis which was confirmed during western blotting.Keywords: Mycobacterium tuberculosis, PPD, ESAT-6, CFP-10, ammonium sulphate, gel chromatography, SDS-PAGE, western blotting
|
| |