توليد آنتي‌بادي پلي‌كلنال عليه ويروس لكه حلقوي نكروتيك هسته‌دارها (PNRSV) با استفاده از پروتئين پوششي نوتركيب

مرکز فناوری اطلاعات و اطلاع رسانی کشاورزی

منو

رکورد قبلی

رکورد بعدی

" توليد آنتي‌بادي پلي‌كلنال عليه ويروس لكه حلقوي نكروتيك هسته‌دارها (PNRSV) با استفاده از پروتئين پوششي نوتركيب "

شماره شناسایی	:	18841690
شماره مدرک	:	۵۴۳۱۸
نام عام مواد	:	[گزارش نهایی -تجاری]
شناسه افزوده	:	فرزادفر، شیرین
	:	پوررحیم، رضا
	:	صفرنژاد، محمدرضا
عنوان اصلي	:	توليد آنتي‌بادي پلي‌كلنال عليه ويروس لكه حلقوي نكروتيك هسته‌دارها (PNRSV) با استفاده از پروتئين پوششي نوتركيب
عنوان اصلي به زبان ديگر	:	:Polyclonal antibody production against Prunus necrotic ring spot virus using recombinant coat protein
صفحه شمار	:	۵۶ ص.:مصور، عکس(رنگی)، جدول، نمودار
وضعیت انتشار	:	تهران: موسسه تحقیقات گیاه‌پزشکی کشور، ۱۳۹۷
فروست	:	شماره ثبت ۵۴۳۱۸ مورخ ۱۳۹۷/۰۷/۰۴
	:	شماره طرح ۹۳۱۳۴-۱۶-۱۶-۲
	:	این طرح: تجاری است
	:	۵۴۳۱۸
خلاصه یا چکیده	:	در روند توليد نهال سالم و نيز مطالعات تعيين پراكنش و مديريت بيماري‌‌‌هاي ويروسي درختان ميوه هسته‌‌‌دار، نیاز به بررسی تعداد زیادی نمونه می‌‌‌باشد. روش سرولوژیکی الایزا هنوز هم یکی از بهترین انتخاب‌‌‌ها برای انجام بررسی آلودگی درختان و نیز صدور گواهی سلامت می‌‌‌باشد. ویروس لکه‌‌‌حلقوی بافت مرده هسته‌‌‌دارها (Prunus necrotic ringspot virus-PNRSV) یکی ازمهم‌‌‌ترین ویروس‌‌‌های آلوده کننده درختان هسته‌‌‌دار می‌‌‌باشد که به جنس Ilarvirus تعلق دارد. فن‌‌‌آوری دی.ان.ای نوترکیب، برای تولید پروتئین پوششی همسانه‌‌‌سازی شده در باکتری، موجب صرفه‌‌‌جویی در هزینه و وقت برای خالص-سازی پيكره ویروس و رفع مشکلات مرتبط با حفظ و نگه‌‌‌داری جدايه‌‌‌هاي ويروس در گلخانه و آزمايشگاه می‌‌‌باشد. در این تحقیق ضمن مطالعه و جمع‌‌‌آوري نمونه‌‌‌هاي مشكوك علائم‌‌‌دار از درختان ميوه هسته‌‌‌دار از پنج استان، جدايه‌‌‌هاي PNRSV با استفاده از آزمون الايزا در آن‌‌‌ها رديابي شده و ژن پروتئين پوششي (CP) آنها همسانه‌‌‌سازي و تعيين توالي گرديد. يكي از جدايه‌‌‌هاي شايع ويروس، انتخاب شده (جدايه PNRSV-PK5) وبا طراحي آغازگرهاي اختصاصي ژن CP اين ويروس، تكثير و در ناقل بیاني pET28a(+) همسانه‌‌‌سازی گردید. پس از تراریخت نمودن سلول‌‌‌های سوش BL21 باکتری E. coli، بیان ژن CP در اين سلول‌‌‌ها با استفاده از SDS-PAGE و وسترن بلات مورد آزمون قرار گرفته و توليد پرتئيني بوزن مورد انتظار حدود 27 كيلودالتون كه با آنتي‌‌‌بادي مرجع PNRSV در آزمون وسترن بلات واكنش مثبت داشت، مورد تایید قرار گرفت. پروتئين پوششي نوتركيب (rCP) خالص‌‌‌سازي شده و با تزريق اين پروتئين در خرگوش سفيد نيوزيلندي، آنتي‌‌‌سرم عليه آن تهيه شد. نتايج آزمون الايزا با استفاده از آنتي‌‌‌بادي اختصاصي عليه جدايه ايراني PNRSV-PK5، نشان داد كه اين آنتي‌‌‌بادي داراي تيتري معادل 1:1000 بود. غلظت بهينه IgG و IgG-Conj تهيه شده در اين تحقيق، بترتيب 2 ميلي‌‌‌گرم در ميلي‌‌‌ليتر و 400 نانوگرم در ميلي‌‌‌ليتر تعيين گرديد و اين سيستم تشخيصي قادر به رديابي آلودگي ويروسي PNRSV در بافت گياهي بود. لغات کلیدی: بيماري‌‌‌هاي ويروسي، تشخيص، رديابي، Prunus necrotic ringspot virus
	:	It is a necessity to test a large number of samples in studies on virus diseases of stone fruit trees and their distribution, as well as in programs of healthy plant material production and certificatin. Enzyme linked immnuosorbent assay (ELISA) is considered as one of the best choices for conducting such large number of infectin assays. Prunus necrotic ringspot virus-PNRSV, belonging to Ilarvirus genus, is one of the most important virus pathogens in stone fruit trees. Production of virus specific antibodies using purified virus particals as imuunogen is laborious and time consuming, in which the need for virus propagation and maintenance in laboratories and greenhouses is a main problem. Recombinant DNA technology has been used for expression of virus coat protein (CP) gene in prokaryotic bacterial cells and the recombinant CP (rCP) is used as an immunogen in antibody production. In this study, the symptomatic samples of stone fruit trees were collected from five provinces of Iran and tested for PNRSV infection using ELISA. CP gene of PNRSV isolates were amplified and cloned using RT-PCR. The nucleotide sequence of the cloned CP gene was then determined. A predominanit PNRSV isolate was selected and its CP gene was cloned into the pET28a(+) expression vector. Expression of rCP in transformed E. coli BL21 competent cells was tested using SDS-PAGE and Western Blot assays. A protein product with the expected weight of about 27 kDa was detected which showed positive reaction with the refrence PNRSV specific antibody. The expressed rCP was purified and injected to the New Zealand white rabbit to produce PNRSV specific antibody. Our antibody against Iranian PNRSV-PK5 isolate showed a titer of 1:1000 in ELISA tests. According to titration assays, the optimum concentrations of the IgG and IgG-Conj produced in this study were 2 mg/ml and 400 ng/ml, respectively. These results confirmed that the developed antibody was able to detec PNRSV in infected plants. Key words: Prunus necrotic ringspot virus, Detection, Recombinant coat protein.